メチシリンの除去 | 広州チタニオ株式会社

軍事医学研究第 10 巻、記事番号: 21 (2023) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

インプラント埋入手術におけるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）バイオフィルム感染症の治療は、チタン（Ti）インプラントの抗菌活性の欠如により制限されています。 MRSA バイオフィルム感染の治療のためのより効果的なアプローチを探索する必要があります。

ここでは、メソポーラスポリドーパミンナノ粒子（PDA）、一酸化窒素（NO）放出ドナーであるニトロプルシドナトリウム（SNP）、および骨形成成長ペプチド（OGP）をTiインプラント上に統合することにより、界面機能化戦略を提案します（Ti-PDA@SNP-と表示されます）。 OGP。 Ti-PDA@SNP-OGP の物理的および化学的特性は、走査型電子顕微鏡、X 線光電子分光法、水接触角、光熱特性、および NO 放出挙動によって評価されました。相乗的な抗菌効果と MRSA バイオフィルムの除去は、2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブ、1-N-フェニルナフチルアミンアッセイ、アデノシン三リン酸強度、o-ニトロフェニル-β-d-ガラクトピラノシド加水分解活性、ビシンコニン酸漏出によって評価されました。蛍光染色、アルカリホスファターゼ活性のアッセイ、コラーゲン分泌および細胞外マトリックスの石灰化、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、および酵素免疫吸着法（ELISA）を使用して、骨髄間質における炎症反応と骨形成能を評価しました。細胞（MSC）、RAW264.7 細胞およびそれらの共培養システム。ギムザ染色、ELISA、マイクロ CT、ヘマトキシリンおよびエオシン、マッソントリクロームおよび免疫組織化学染色を使用して、生体内での MRSA バイオフィルムの根絶、炎症反応の阻害、および Ti-PDA@SNP-OGP のオッセオインテグレーションの促進を評価しました。

Ti-PDA@SNP-OGP は、近赤外光照射後の MRSA に対して光熱と NO 依存性の相乗的な抗菌効果を示し、活性酸素種 (ROS) 媒介の酸化ストレスを誘導して細菌膜の完全性を破壊することにより、形成された MRSA バイオフィルムを効果的に除去しました。細胞内成分の漏出を引き起こします (P < 0.01)。インビトロ実験により、Ti-PDA@SNP-OGP は MSC の骨形成分化を促進するだけでなく、炎症促進性 M1 マクロファージの抗炎症性 M2 表現型への極性化も促進することが明らかになりました (P < 0.05 または P < 0.01)。好ましい骨免疫微小環境は、複数のパラクリンシグナル伝達経路を介して、間葉系幹細胞の骨形成とRAW264.7細胞の抗炎症をさらに促進しました（P < 0.01）。 in vivo 評価により前述の結果が確認され、Ti-PDA@SNP-OGP が MRSA 感染大腿骨欠損移植モデルにおけるオッセオインテグレーションの改善を誘導したことが明らかになりました (P < 0.01)。

これらの発見は、Ti-PDA@SNP-OGP がインプラント交換手術における MRSA 感染症の高効率治療に有望な多機能材料であることを示唆しています。

生体材料関連感染 (BAI) は世界的な健康負荷であり、米国のすべての院内感染の約 40% の原因となっています [1]。感染はインプラントの耐用年数全体にわたって発生しますが、インプラントプロセス中だけではなく、チタン (Ti) インプラントの破損を必然的に引き起こします [2、3]。 Ti インプラントの表面にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) バイオフィルムが形成されると、BAI の負担が悪化します [4]。細胞外高分子物質（EPS）は、MRSAによって分泌されるマトリックス中に存在し、宿主の免疫系や抗生物質の浸透や環境圧力などの外部環境の課題から膜内細菌を保護します[5、6]。従来の抗生物質はMRSAバイオフィルムの除去に効果がないため、インプラント関連のMRSA感染症の管理においては、感染したインプラントの除去と交換がホブソン医師の選択となることが多い[7、8]。 Ti インプラントの術後オッセオインテグレーション能力が理想的とは言えないため、その有効性はさらに低下します [9]。したがって、薬剤耐性を誘発することなく、MRSAバイオフィルムの除去とTiインプラントのオッセオインテグレーションの改善を同時に行う新しい戦略を開発する必要がある。

光熱療法 (PTT) は、バイオフィルムを除去するために広く研究されている非侵襲的なアプローチです。このアプローチは、深部組織浸透、適用適応性、高い選択性、薬剤耐性のリスクが低い、および副作用が最小限であることを特徴としています[10、11、12]。一般的に使用される光熱剤には、金属ナノ粒子 (金や銅のナノ粒子など)、有機分子 (ポルフィリン、インドシアニングリーン、チアジアゾール誘導体など)、炭素系材料 (酸化グラフェン、カーボンナノチューブ、窒化炭素など)、金属硫化物 (酸化グラフェン、カーボンナノチューブ、窒化炭素など) が含まれます。例：硫化銅、硫化第一銅、二硫化モリブデン）[13,14,15,16,17]。ポリドーパミンナノ粒子 (PDA) は、高い光熱変換能力、優れた生体適合性、および修飾の可能性により、有望な光熱剤です [18、19、20]。以前の研究では、ラウリン酸グラフトキトサン、ジベンズアルデヒド修飾ポリエチレングリコール、クルクミン担持PDAナノ粒子からなる複合ヒドロゲルが、創傷感染に対して強力な抗菌能力を示すことが報告されている。この活性は、近赤外光 (NIR) によって引き起こされるクルクミンのオンデマンド放出と温熱療法の間の相乗効果によるものであると考えられています [21]。ただし、バイオフィルムは 70 °C で NIR 照射を適用することによってのみ除去されました。人体は短時間であれば比較的高い局所温度に耐えることができますが、高温条件下では周囲の正常組織が損傷を受ける可能性があります[22、23]。 PTT によって誘発される穏やかな温度 (約 5 °C) では悪影響は少なくなりますが、その穏やかな温度では抗菌および抗バイオフィルム活性が大幅に低下します [24、25]。この問題に対処するために、科学者たちは、バイオフィルム形成の阻害と確立されたバイオフィルムの除去のために、PTT と抗菌剤の適用を組み合わせました。

ガス療法と PTT の組み合わせは、細菌感染、感染した創傷、炎症、心血管疾患、および癌に対する PTT の有効性を改善するための有益なアプローチです [26、27、28]。ガス療法による細菌感染症の治療には、水素、硫化水素、一酸化炭素、二酸化炭素、二酸化硫黄、一酸化窒素 (NO) などの大量のガス分子の使用が含まれます [29,30,31,32,33, 34]。 NO は、生理学的および病理学的プロセスにおける重要な内因性ガス分子です。 NO の抗菌効果は、高濃度でのタンパク質や DNA 分子に対する有害な影響によるものと考えられています。 NO は、薬剤耐性を引き起こすことなく、哺乳動物への細菌の侵入に対して強力な抗菌活性を持っています [35、36]。それにもかかわらず、細菌感染症の治療におけるガス療法の使用は、感染部位での不十分なガス蓄積、制御されていない放出挙動、および不正確な治療メカニズムによって制限されている[37、38]。現在までに、さまざまな NO 誘発アプローチが研究されています。これらのアプローチには、グルタチオン、酵素、pH、H2O2、および光熱処理が含まれます。それらの中で、PTT は、深部組織への浸透と、NIR 照射下での NO の制御可能な放出挙動のため、有望かつ効率的なアプローチです [23]。したがって、ガス療法の特異性を改善するために、「オンデマンド」放出挙動を備えたNIRレーザー刺激ドラッグデリバリーシステムを開発することが急務となっている。

ナノテクノロジーの発展により、ジアゼニウムジオレート (NONOエート)、N,N'-ジセクブチル-N,N'-ジニトロソ-p-フェニレンジアミン (BNN6)、S-ニトロソグルタチオン (GSNO)、および L-アルギニン (L-Arg) が開発されました。 NO ドナーとして広く使用されています [23、28]。しかし、副産物の毒性、短い半減期、不十分なガス蓄積、制御されていない放出挙動、および不正確な治療機構などの問題により、これらの化合物の生体内での治療効果が弱まります[28]。比較すると、ニトロプルシドナトリウム（SNP）は他のものよりも生体適合性が高く、高温に敏感なため、NOの「オンデマンド」放出のための光熱誘発ドナーとして使用できる可能性があります[39、40]。

この研究では、MRSAバイオフィルムの根絶とオッセオインテグレーションの強化を達成するために、Tiインプラント上でNOガス療法、PTTとペプチド薬物療法を組み合わせる多機能戦略が提案されました。

Ti ロッド (長さ: 10 mm、直径: 15 mm) および Ti フォイル (10 mm × 10 mm、厚さ 0.25 mm) は、北西非鉄金属研究所 (中国、西安) から入手しました。塩酸ドーパミン、二酢酸フルオレセイン、ヨウ化プロピジウム、Pluronic F-127、DCFH-DA、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（ONPG）およびHoechst 33258は、MilliporeSigma（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。 SNP、トリス(ヒドロキシメチル)アニモメタン (Tris)、1,3,5-トリメチルベンゼン、ポリミキシン B、および N-フェニル-1-ナフチルアミンは、Aladdin Industrial Co. Ltd. (上海、中国) から購入しました。細胞計数キット-8 (CCK-8)、ミューラーヒントンブロス (MHB)、アガロースおよびパラホルムアルデヒドは、Solarbio Biotechnology Co. (北京、中国) から入手しました。ビシンコニン酸（BCA）アッセイキット、グリース試薬、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）アッセイキット、BCIP/NBTアルカリホスファターゼ（ALP）染色キット、ALPアッセイキット、シリウスレッド染色キット、アリザリンレッドナトリウム塩、強化アデノシン三リン酸（ATP）アッセイキット、3,3'-ジアミノベンジジン (DAB) 検出キット、ヘマトキシリンおよびエオシン (HE) 染色キット、マッソントリクローム染色キット、およびギムザ染色キットは、Beyotime Biotechnology Co. (江蘇省、中国) から購入しました。骨形成成長ペプチド (OGP、ALKRQGRTLYGFGG) は、Top-Peptide Co., Ltd. (上海、中国) から購入しました。ローダミンファロイジン、トリゾール試薬、およびプライマーは、Invitrogen Co. (カリフォルニア州、米国) から購入しました。 Runt 関連転写因子 2 (Runx2)、骨形成タンパク質 2 (BMP2)、血管内皮増殖因子 (VEGF)、トランスフォーミング増殖因子 β (TGF-β)、腫瘍用の酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) キット壊死因子-α (TNF-α)、インターロイキン-6 (IL-6)、および IL-10 は、ABclonal Biotechnology から購入しました。株式会社（中国・武漢）。他の化学物質は Xingguang Chemical Co. (重慶、中国) から購入しました。

プルロニックＦ−１２７（０．３６ｇ）および１，３，５−トリメチルベンゼン（０．３６ｇ）を混合し、Ｈ２Ｏ（６５ｍｌ）およびエタノール（６０ｍｌ）の混合物に溶解した。トリス（９０ｍｇ）およびドーパミン塩酸塩（６０ｍｇ）を加え、暗所下で２４時間撹拌した。鋳型とＰＤＡを遠心分離により除去した。ＰＤＡをエタノールとアセトンの混合物で３回洗浄した。合成された PDA ナノ粒子はエタノールに分散され、その後の分析のために -20 °C で保存されました。

PDA@SNP ナノ粒子は、PDA (5 mg) ナノ粒子をエタノールに分散させることによって調製されました。予め調製したＳＮＰ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）を撹拌条件下で導入した。２４時間後に黒色混合物を遠心分離（１１，０００ｒ／分、１０分）によって収集し、ＰＤＡ＠ＳＮＰナノ粒子を脱イオン水ですすいだ。

PDA@SNP ナノ粒子を、OGP (2 mg/ml) を含む Tris-HCl 緩衝液 (10 mmol/L、pH 8.5) に浸漬して、OGP の共有結合固定化を確実にしました。混合物を24時間撹拌した後、PDA@SNP-OGPナノ粒子を収集し、脱イオン水ですすいだ。 PDA、PDA@SNP、および PDA@SNP-OGP の形態を透過型電子顕微鏡 (TEM、Talos F200S、ThermoFisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) によって分析しました。 PDA@SNP ナノ粒子に結合した OGP の総量は、紫外可視 (UV-Vis) 分光光度計 (UV-3600、島津製作所、日本) によって測定されました。

きれいなTiフォイルを、10 mmol/L Tris緩衝液（20 ml、pH 8.5）を含むドーパミン塩酸塩溶液（2 mg/ml）に浸し、24時間インキュベートしました。続いて、ＰＤＡ、ＰＤＡ＠ＳＮＰ、またはＰＤＡ＠ＳＮＰ－ＯＧＰナノ粒子（０．３ｍｇ）を、ドーパミンコーティングを介してＴｉ基板上に固定化した。試験片は脱イオン水ですすぎ、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、または Ti-PDA@SNP-OGP と表示されます。これらの基板の形態、表面化学、および水接触角（WCA）は、走査型電子顕微鏡（SEM、Quattro S、ThermoFisher Scientific、Waltham、MA、USA）、X 線光電子分光器（XPS、Empyrean、オランダ）によって分析されました。および接触角ゴニオメトリー（SDC-200S、シンディン、中国）をそれぞれ。 Ti インプラント上の PDA@SNP-OGP コーティングの断面画像と厚さを SEM で観察しました。コーティングの接着強度は、スクラッチテスター（CSM Instruments、スイス）を使用して調査されました。

調製されたナノ粒子の光熱効果は、808 nm レーザー (Mild-River Company、中国) から放射される NIR 放射を使用して評価されました。リアルタイムの温度変化は、デジタル温度計 (HH806AU、Omega Engineering、ノーウォーク、コネチカット州、米国) を使用して記録されました。簡単に説明すると、PDA、PDA@SNP、および PDA@SNP-OGP ナノ粒子 (0.5 mg/ml) を 808 nm レーザー (1.00 W/cm2) に 10 分間曝露しました。 PDA、PDA@SNP、および PDA@SNP-OGP ナノ粒子 (0.5 mg/ml) の光熱変換効率 (η)、加熱曲線および冷却曲線は、次の方程式に従って評価されました。

ここで、Tmax は試料 (PDA、PDA@SNP または PDA@SNP-OGP ナノ粒子) によって誘発される最高温度、Tmax,water は水の最高温度、Tsurr は周囲の室温です。 Q0 は、試料なしのバックグラウンドエネルギー入力であり、式 (1) から計算されます。 (3)。 I はレーザー出力 (1 W/cm2)、A808 は 808 nm でのサンプル (PDA、PDA@SNP および PDA@SNP-OGP ナノ粒子) の吸光度、h は熱伝達係数、S はサンプル容器の表面積です。、md は PDA、PDA@SNP、または PDA@SNP-OGP ナノ粒子溶液の重量、cd は水の熱容量です。

天然 Ti または機能化 Ti 基板の光熱効果は、赤外線熱画像システム (E40 IR 画像システム、FLIR、米国オレゴン州ウィルソンビル) を使用して評価されました。 Tiをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）緩衝液（500μl）に浸し、NIR照射（1.00W/cm2、10分間）に曝露した。各試験片の温度変化を記録し、時間間隔を 30 秒に設定しました。さらに、異なる NIR 出力密度 (0.25、0.50、1.00、および 1.25 W/cm2) で照射された Ti-PDA@SNP-OGP の温度変化を評価しました。

NO レベルを測定するために Griess 試薬を使用しました。 Ti-PDA@SNP-OGP を NIR (1.00 W/cm2) に 10 分間曝露し、続いて NIR 照射なしで 20 分間曝露し、この手順を 5 回繰り返しました。得られた培地をグリース試薬（50μl）で処理した。 Ti-PDA@SNP-OGP から放出された NO の量は、UV-Vis 分光光度計を使用して 548 nm で測定されました。 Ti、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、および Ti-PDA@SNP-OGP からの NO の累積放出プロファイルも評価しました。放出された NO の濃度は、標準曲線を使用して計算されました。

MRSA (ATCC33591) を使用して抗バイオフィルム特性を評価しました。標本を 1 ml MRSA 懸濁液 [1 × 108 コロニー形成単位 (CFU)/ml] で定常増殖期に 37 °C で 3 日間培養し、MHB 培地を毎日交換しました。抗バイオフィルムの特性とメカニズムは、スプレッドプレートアッセイ、SEM 検査、活性酸素種 (ROS) 生成、膜透過性、ATP 強度、NIR 照射の有無にかかわらず ONPG 加水分解を使用して決定されました。

抗バイオフィルム活性を調べるために、標本を定常増殖期に 1 ml MRSA 懸濁液 (1 × 108 CFU/ml) で培養し、37 °C で 3 日間インキュベートしました。次に、標本を NIR 照射 (1.00 W/cm2) に 10 分間曝露しました。付着していない細菌は、ＰＢＳで穏やかに洗浄することによって除去した。１ミリリットルの滅菌ＰＢＳを各ウェルに添加し、１０分間の超音波処理によって処理されたＭＲＳＡを基板から除去した。細菌懸濁液を滅菌 PBS で 10,000 倍に希釈しました。次に、100μlの希釈細菌懸濁液を寒天プレート上に広げた。 CFU を画像化して計数しました。各基材の抗菌率は、次の式を使用して計算されました。A = (B – C)/B × 100%。ここで、A は抗菌率、B は対照群 (Ti) の平均 CFU、C は実験群の平均 CFU です。

MRSAバイオフィルムは、NIR照射の有無にかかわらず、Tiまたは官能化Ti基板上で10分間培養されました。バイオフィルムを超音波で剥離し、細菌懸濁液を生成しました。懸濁液をシリコンウェーハに添加し、パラホルムアルデヒド (4 wt%) を用いて 4 °C で一晩固定しました。試料を上昇エタノール系列 (25%、50%、75%、100%) で脱水し、さらに tert-ブタノールで 10 分間脱水しました。乾燥した標本は、SEM 検査のために金でスパッタリングコーティングされました。

異なるグループにおける ROS 生成は、2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート (DCFH-DA) プローブを使用して評価されました。 MRSA 懸濁液 (1 ml、1 × 106 CFU/ml) を、808 nm NIR レーザー照射の有無にかかわらず、Ti、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、または Ti-PDA@SNP-OGP 上で培養しました。細菌懸濁液を２４時間インキュベートし、ＤＣＦＨ－ＤＡ溶液（１０μｍ）で処理した。標本を 30 分間インキュベートした後、励起波長 488 nm、発光波長 525 nm の蛍光分光光度計 (RF5301PC、島津製作所、京都、日本) を使用して蛍光強度を測定しました。

1-N-フェニルナフチルアミン (NPN) 蛍光プローブ法を使用して、MRSA の膜透過性を調べました。遠心分離（５０００ｒ／分、８分）によりＭＲＳＡ懸濁液を得て、ＮＰＮ蛍光プローブ（１０μｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ）で３０分間処理した。溶液の蛍光強度は、蛍光分光光度計(励起波長350nm、発光波長420nm)を使用して測定した。ポリミキシン B で処理した MRSA 懸濁液を陽性対照として使用しました。実験グループの蛍光強度を対照グループ（NIR照射なしのTi）の蛍光強度に対して正規化しました。

BCA アッセイは、さまざまな治療後の MRSA のタンパク質漏出を調査するために実行されました。 MRSA (1 ml、1 × 106 CFU/ml) を Ti、Ti-PDA、Ti-MPDA@SNP、または Ti-PDA@SNP-OGP 上にシードしました。その後、培地を回収し、20 秒間ボルテックスしました。その後、混合物（４００μｌ）を取り出し、シリンジフィルター（０．２２μｍ）で濾過した。次に、濾液サンプル (25 μl) を標準 BCA タンパク質アッセイキットに加え、穏やかに振盪 (200 r/min) しながら 37 °C でインキュベートしました。最後に、分光測光マイクロプレートリーダー (Bio-Rad 680、Hercules、CA、USA) を使用して、得られた溶液の吸光度を 490 nm で測定しました。タンパク質漏出量＝（各実験群のタンパク質量−対照群のタンパク質量）。 MRSAを添加しないTi、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、Ti-PDA@SNP-OGPを含むLB培地を対照群として使用し、Ti、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、およびMRSAを添加するLB培地を使用した。 MRSAを添加したTi-PDA@SNP-OGPを実験群として使用した。

ATP アッセイキットを使用して、さまざまな条件下で MRSA の ATP 強度を評価しました。 MRSA (1 ml、1 × 106 CFU/ml) を Ti、Ti-PDA、Ti-MPDA@SNP、または Ti-PDA@SNP-OGP 上に播種しました。各グループの標本の半分は NIR 照射にさらされ、残りの半分は照射されませんでした。 ATP 強度は、蛍光分光光度計を使用して 562 nm で評価しました。実験グループの相対蛍光強度は、蛍光強度をNIR照射なしの純粋なTi（対照グループ）の強度に対して正規化することによって得られました。

ONPG 加水分解は、MRSA バイオフィルム内に存在する細菌の膜透過性を評価するために実施されました。 MRSAバイオフィルムを10分間808 NIR照射の有無にかかわらず処理した。異なる基板上で成長したバイオフィルムを超音波処理（10分間）によって収集し、ONPG溶液（500μl、0.75mol/L）とともにインキュベートした。上清の光学密度値は、分光測光マイクロプレートリーダー (Bio-Rad 680、Hercules、CA、USA) を使用して 405 nm で測定しました。

呼吸鎖デヒドロゲナーゼ活性については、MRSA (1 ml、1 × 106 CFU/ml) を Ti、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、Ti-PDA@SNP-OGP とレーザー照射あり/なしで 37°でインキュベートしました。 ℃で１２時間。次に、培養培地（２５０μｌ）、グルコース溶液（１ｍｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液（１ｍｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ＝８．６）、４％２、３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）溶液およびＬＢブロス（２５０μｌ）をチューブに加えた。 6時間インキュベートした後、濃硫酸(50μl)を上記混合物に添加して反応を停止させた。その後、生成した酵素反応生成物[1,3,5-トリフェニルホルマザン(TPF)]をトルエンで抽出した。最後に、分光測光マイクロプレートリーダー (Bio-Rad 680、Hercules、CA、USA) を使用して、得られた溶液の吸光度を 490 nm で測定しました。呼吸鎖脱水素酵素の相対活性（％）は、次の式に従って計算した：Ａ＝Ｂ／Ｃ×１００％。ここで、Aは呼吸鎖デヒドロゲナーゼの相対活性を示します。 B は対照 (NIR 照射なしの Ti) の平均 OD490 値です。 C は実験サンプルの平均 OD490 値です。

細菌の膜の完全性を評価する指標としての細胞内成分の漏出をOD260法により測定した。 1 ml の MRSA (5 × 108 CFU/ml) を Ti、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、および Ti-PDA@SNP-OGP 基質で培養しました。各グループの標本の半分は NIR 照射にさらされ、残りの半分は照射されませんでした。その後、シリンジフィルター（０．２２μｍ）で濾過し、細菌等を除去した。最後に、得られた溶液の吸光度を紫外可視分光光度計 (UV-3600、島津製作所、日本) によって 260 nm で測定しました。

骨髄間質細胞（MSC）は、以前に報告されているように、10匹のSprague-Dawley（SD）ラット（雄、100〜120 g）の脛骨および大腿骨から単離されました[41、42、43]。 SD ラットは重慶医科大学から提供され、実験動物の生産ライセンス番号は SCXK 2022-0010 でした。培地を2日ごとに交換し、3回目の継代からのMSCをその後の実験に使用した。 RAW264.7 細胞 (陸軍医科大学、重慶、中国) を、ストレプトマイシン/ペニシリンおよび 5% 以下の 10% (v/v) ウシ胎児血清 (Hyclone、米国) を添加した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) で培養しました。 37℃のCO2。

骨MSC（1×104細胞/ウェル）またはRAW264.7細胞（1×104細胞/ウェル）を異なる基質とともに2日間インキュベートしました[20]。次いで、細胞をTriton X-100 (0.2%)で5分間溶解し、細胞骨格染色のためにローダミン-ファロイジン溶液で一晩処理した。染色後、標本をＰＢＳですすぎ、ＭＳＣまたはＲＡＷ２６４．７細胞の核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（２００μｌ）で染色した。

MSC または RAW264.7 細胞の形態学的変化は、共焦点レーザー走査型顕微鏡 (CLSM; FV3000、オリンパス、東京、日本) を使用して評価されました。

1、4、または7日間のインキュベーション後、CCK-8溶液と培地の混合物(1:9、v/v)を各グループのウェルに添加した。上清の光学密度値は、分光測光マイクロプレートリーダーを450 nmで使用して2時間インキュベートした後に測定した。 RAW264.7細胞を異なる基質上で1、3、および5日間培養しました。 CCK-8 アッセイは、細胞増殖を評価するために実行されました。

異なる基質上で 7 日間培養した細胞を、ALP キットを使用して分析しました。異なる基質上で培養した骨MSCをシリウスレッド溶液で2時間染色しました。染色された細胞をNaOHで処理して、赤い結晶を溶解しました。上清の光学密度値は、分光測光マイクロプレートリーダーを使用して540 nmで測定されました。

追加の MSC を 21 日間インキュベートし、アリザリンレッド (0.1%) で染色して、細胞外マトリックス (ECM) の石灰化レベルを評価しました。

染色された鉱物小結節を CH3COOH 溶液 (10%) で溶解し、マイクロプレートリーダーを使用して上清の光学密度値を 405 nm で測定しました。

RAW264.7 細胞 (5 × 104 細胞/ml) を、培地にリポ多糖 (LPS) 溶液 (40 ng/ml) を添加してマクロファージの M1 型への分極を刺激し、その後、さまざまな基質と共インキュベートすることによって活性化しました。 24 時間培養後、M1 型 [CD86、誘導性一酸化窒素合成酵素 (iNOS) および CD11C]、M2 型 [CD206、アルギナーゼ-1 (Arg)] の代表的な遺伝子の発現量に基づいて抗炎症活性を評価しました。 -1) および CD163]、炎症誘発性サイトカイン (TNF-α および IL-1β)、および抗炎症性サイトカイン (IL-10 および IL-1ra)。

骨MSCまたはRAW264.7細胞を、異なる基質を含む24ウェルプレートで培養しました。 Total RNA キット (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して、MSC または RAW264.7 細胞から全 RNA を抽出しました。逆転写キット（タカラ、滋賀県、日本）を使用して、RNA を相補 DNA に逆転写しました。 qRT-PCR には Bio-Rad CFX Manager システムを使用しました。使用したプライマーは追加ファイル 1: 表 S1 にリストされています。遺伝子発現の相対レベルは、発現レベルをハウスキーピング遺伝子 β-アクチンのレベルに対して正規化することによって得られました。

異なる基質に播種した RAW264.7 細胞によって分泌される TNF-α、IL-1β、IL-10、および IL-6 の濃度を ELISA キットを使用して測定しました。 RAW264.7細胞（5×104細胞/ml）を異なる基質上で培養し、3日間インキュベートしました。サンプルを遠心分離し、上清を収集し、標準曲線を使用してサイトカイン濃度を決定しました。

RAW264.7 細胞の影響下での MSC の骨形成分化を評価するために、Transwell 共培養実験を実行しました。骨MSC（1×104細胞/ウェル）を上部Transwellチャンバー（Corning、ニューヨーク、米国、孔径：8μm、内径：6.5mm）に播種し、RAW264.7細胞と24時間共培養しました。 [41]。膜を通って移動したMSCを4%パラホルムアルデヒドで固定し、1%クリスタルバイオレット試薬で染色した。染色されたMSCを倒立顕微鏡(Zeiss、イエナ、ドイツ)を使用して分析した。

RAW264.7 細胞 (1 × 104 細胞/ウェル) を Ti または機能化 Ti 基板上で 2 日間培養しました。検体調整培地を収集し、遠心分離（1000 r/分、4 分）して残留細胞を除去しました。次いで、ＭＳＣを、各群からの条件培地（１ｍｌ）を添加して２４ウェルプレート上で培養した。標本馴化培地は2日ごとに交換した。細胞を、所定の時間に5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)/ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、シリウスレッドおよびアリザリンレッドS染色試薬で処理した。骨形成関連遺伝子 (Runx2、BMP2、ALP、OPN、OCN) の mRNA 発現レベルを評価しました。

すべての in vivo 動物実験は、重慶医科大学および人民解放軍総合病院第 7 医療センターの実験動物の動物実験に関する施設ガイドラインおよび関連規制に従って実施され、重慶医科大学の動物倫理委員会によって承認されました (2021- 738) および人民解放軍総合病院第 7 医療センター (2021-110)。重慶医科大学から 40 匹の SD ラット (雄、200 ～ 250 g) が提供され、移植手術に使用されました。ラットに麻酔をかけ、手術部位の毛を剃って消毒した。 MRSA感染大腿骨欠損モデルは、骨髄腔の方向に大腿骨顆の中心に外科用ドリルを使用して円筒形の欠損(直径1.5 mm)を作成することにより、正常に構築されました。 MRSAバイオフィルムが形成された準備されたTiインプラントを骨欠損部に静かに挿入した後、手術部位を縫合した。移植部位を NIR 照射 (1.00 W/cm2) に 10 分間曝露し、サーマルカメラを使用してリアルタイムの温度変化を記録しました。

移植の 3 日後にラットを屠殺し、大腿骨サンプルを収集し、埋め込まれたインプラントを静かに取り外しました。インプラントを MHB に浸し、超音波処理して付着した MRSA を剥がしました。細菌懸濁液を 12 時間培養し、希釈 (10,000 倍) して MHB 寒天プレートに接種しました。各検体の抗バイオフィルム効果を調査しました。プレート上の細菌コロニーを評価し、37 °C で 24 時間培養した後に写真を撮りました。インプラントをMHB培地に浸し、14時間培養しました。各グループの濁度を写真に撮り、濁度レベルを求めた。一方、ELISAを実行して、TNF-α、IL-6、TGF-βおよびIL-10濃度を測定した。さらに、骨免疫調節効果を調査するために、抗 CD68 抗体および抗 CD206 抗体を使用して HE および免疫組織化学 (IHC) 染色が行われました [42]。骨組織切片を脱脂し、一連の降下エタノール (100 ～ 50%) で水和し、抗原を回収し、30 分間ブロックし、一次抗体 (CD86 および CD206) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。次に、切片を対応するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体で室温で 1 時間処理し、発色反応のために DAB 検出キットで染色し、ヘマトキシリンで対比染色しました。

移植後 30 日後にラットを屠殺し、移植片と元の骨組織との間のオッセオインテグレーションの程度を調べた。分析は、マイクロコンピュータ断層撮影法 (マイクロ CT; Viva CT40、SCANCO Medical AG、ブルッティゼレン、スイス)、HE、およびマッソントリクローム染色を使用して実施されました。マイクロ CT では、採取した大腿骨をホルマリン試薬で固定し、2 日間インキュベートしました。治療された大腿骨はマイクロ CT でスキャンされ、以前に記載されているように分析されました [42]。 HE およびマッソントリクローム染色では、インプラントを大腿骨から静かに取り外して染色しました。染色標本は倒立顕微鏡（Zeiss）を用いて観察した。生物学的安全性も全血生化学分析を使用して評価されました。

すべてのデータは平均値 ± 標準偏差 (SD) として表されました。データは、統計分析のための一元配置分散分析 (ANOVA) を介した Tukey の検定によって、Origin ソフトウェア (バージョン 8.0) で処理されました。統計的有意性は α = 0.05 に事前設定されました。

図1aに示すように、PDAは平均直径（176±12）nmのよく分散した球形形態を示しました。 PDA@SNP および PDA@SNP-OGP の平均直径は、SNP および OGP 修飾の負荷後、それぞれ (183 ± 18) nm および (196 ± 21) nm までわずかに増加しました。 TEM元素マッピングにより、鉄（Fe）がPDA@SNP-OGP中に均一に分布していることが示されました（図1b）。微分光散乱は、PDA@SNP-OGPのサイズがPDAおよびPDA@SNPのサイズよりも比較的大きいことを示しました（追加ファイル1：図S1a）。これはTEM画像と一致しています。フーリエ変換赤外分光法 (FTIR) の結果によれば、1125 および 840 cm-1 の吸収バンドはベンゼン環の υ-NH および υ-Ar に起因すると考えられます。 2102および1885cm-1におけるPDA@SNPの吸収ピークは、υ-CN（アキシャルおよびエクアトリアルCNリガンド）およびυ-NOに対応し、SNPがPDA上にうまくロードされたことを示した。 SNP の υ-CN および υ-NO バンド、OGP の υ-NH2 および υ-CONH バンドは、OGP による修飾後に観察されました（追加ファイル 1：図 S1b）。事前に作成された標準曲線[40]に基づくと、UV-Vis光分光スペクトルを使用した場合、PDA@SNPのSNP負荷率は8.92％でした（追加ファイル1：図S1c）。

Ti-PDA@SNP-OGP の特性評価。 a PDA、PDA@SNP、または PDA@SNP-OGP ナノ粒子の透過型電子顕微鏡 (TEM) 画像。スケールバー = 100 nm。 b PDA および PDA@SNP-OGP ナノ粒子の元素マッピング。スケールバー = 100 nm。 c Ti、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、または Ti-PDA@SNP-OGP の走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像。スケールバー = 1 μm。 d Ti、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、および Ti-PDA@SNP-OGP の水接触角 (WCA)。 e 異なる出力強度でのNIR照射を使用したTi-PDA@SNP-OGPの加熱曲線。 f NIR 照射 (808 nm、1.00 W/cm2) による Ti、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP または Ti-PDA@SNP-OGP の加熱曲線。 g 10 分間の NIR 照射 (808 nm、1.00 W/cm2) の有無による、Ti-PDA@SNP または Ti-PDA@SNP-OGP からの NO の累積濃度。 **P < 0.01; チタン、PDA ポリドーパミンナノ粒子、SNP ニトロプルシドナトリウム、OGP 骨形成成長ペプチド、NO 一酸化窒素、NIR 近赤外光

SEM を使用して、Ti または機能化 Ti 基板の形態を検査しました。 Ti は比較的滑らかな表面を持っていました (図 1c)。 PDA、PDA@SNP、および PDA@SNP-OGP は、形態に明らかな違いがなく、Ti 上に均一に分布していました。 Ti-PDA@SNP-OGP における Ti、O、C、N、Fe の分布の元素マッピング。 Ti の XPS 分析により、Ti (88.92%) と O (11.08%) のシグナルが確認されました。 Ti-PDA@SNP-OGP に関しては、3 つの新しいピーク (C、N、および Fe) が特定されました (追加ファイル 1: 図 S1d)。 Ti-PDA@SNP-OGP の C 1 s スペクトルは、主要ピークが次の位置に集中していることを示しました: C=O (287.7 eV)、C-O (286.3 eV)、C-N (285.4 eV)、C -C (284.6 eV)、および C=C (284.1 eV)。 532.9 および 531.0 eV の 2 つの O 1 s ピークは、OC および O=C に起因すると考えられます。 Ti-PDA@SNP-OGP の N 1 s 高分解能スペクトルでは、399.8、399.2、398.9、および 398.2 eV の 4 つのサブピークが、-NH2、-N=O、-N=C、N- に割り当てられました。 C、それぞれ（追加ファイル1：図S1e）。これらの結果は、OGP によって PDA@SNP-OGP に加えられた変更を示しています。 Ti は、WCA が (60.0 ± 5.6)°であり、より疎水性でした。 Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、Ti-PDA@SNP-OGPのWCAは、それぞれ(35.0±4.2)°、(32.4±5.0)°、(37.7±4.8)°でした（図1d）。 Ti上のPDA@SNP-OGPコーティングの断面SEM画像を示しました。 Ti上のコーティングの厚さは3.7〜8.3μmの範囲でした（追加ファイル1：図S2a）。 Ti 上の PDA@SNP-OGP コーティングの接着強度は、スクラッチテスター (CSM Instruments、スイス) を使用して測定されました。 Ti-PDA@SNP-OGPの臨界荷重（Lc1およびLc2）は、それぞれ約1.14および1.26Nでした（追加ファイル1：図S2b）。データは、Ti に塗布した後の PDA@SNP-OGP コーティングの機械的安定性が良好であることを示唆しています。この観察は、以前の研究 [4] の結果と一致していました。

デジタル NIR 光熱イメージングシステムを使用して、さまざまな NIR 出力強度での Ti-PDA@SNP-OGP の光熱効果を評価しました。 Ti-PDA@SNP-OGP の照射後の温度は、0.25 W/cm2 で 35.6 ℃、0.50 W/cm2 で 41.3 ℃、1.00 W/cm2 で 52.3 ℃、1.25 W/cm2 で 62.3 ℃でした。 10 分 (図 1e)。照射電力 (1.00 W/cm2) を使用して、Ti または機能化 Ti 基板の温度変化をさらに評価しました。 10分間の照射後、Tiの温度は25.0℃から33.7℃に上昇した。ただし、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、Ti-PDA@SNP-OGPの温度は、それぞれ52.8、52.0、52.1℃に上昇しました（図1f）。 Ti-PDA@SNP-OGP の光熱変換効率 (η) は、NIR 照射への曝露後 20.3% であることがわかりました (追加ファイル 1:図 S2c)。 Ti-PDA@SNP-OGP の形態は、NIR 照射（1.00 W/cm2、10 分）後も変化しませんでした（追加ファイル 1：図 S2d）。

Ti-PDA@SNP および Ti-PDA@SNP-OGP から放出された NO の累積濃度は、NIR 照射 10 分後にそれぞれ (15.9 ± 1.2) μmol/L および (15.1 ± 1.1) μmol/L でした。ただし、Ti-PDA@SNPまたはTi-PDA@SNP-OGPから放出されたNOの累積濃度は、NIR照射なしでは増加しませんでした（図1g）。 NIR照射したTi-PDA@SNP-OGPから放出されたNOの累積濃度は大幅に増加し（ P < 0.01、追加ファイル1：図S2e）、30分後には（34.6±2.4）μmol / Lに達しました（追加ファイル1）：図S2f）、NOリリース用のNIRトリガーの「オンオフ」スイッチモードを生成します（追加ファイル1：図S2g）。ただし、72時間のインキュベーション後にTi-PDA@SNP-OGPから放出されたNOの累積濃度は、NIR照射なしではわずか（4.9±0.8）μmol/Lでした（追加ファイル1：図S2h）。

希釈拡散平板法を使用して、NIR 照射の有無にかかわらず、Ti または官能化 Ti 基板上での MRSA バイオフィルムの阻害と根絶を調査しました。すべての基材は、NIR 照射なしでは MRSA コロニーに対して明らかな静菌特性を示さなかった。逆に、Ti-PDA@SNP または Ti-PDA@SNP-OGP では寒天プレート上に形成された MRSA コロニーの数は、NIR 照射後に Ti に比べて著しく減少しました（図 2a）。 10 分間の NIR 照射後、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、Ti-PDA@SNP-OGP による MRSA バイオフィルムの除去率は、(62.4 ± 7.6)%、(98.7 ± 2.6)%、(97.6 ±) でした。それぞれ 4.7)% (図 2b)。 SEM 画像に基づくと、MRSA は、NIR 照射なしで、Ti、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、または Ti-PDA@SNP-OGP 上で球状で一体化した膜構造を示しました。 NIR 照射後、Ti-PDA 中で MRSA バイオフィルムは部分的に破壊され、細胞膜は萎縮して損傷を受けました (赤い矢印で示されています)。ＮＩＲ照射後、Ｔｉ上のＭＲＳＡバイオフィルムの形態は依然として滑らかで緻密であった。対照的に、Ti-PDA@SNP または Ti-PDA@SNP-OGP では、MRSA バイオフィルムは除去され、ほとんどの細菌は死滅しており、焦点を合わせることができませんでした（図 2c）。

NIR照射の有無にかかわらず、Ti-PDA@SNP-OGPのインビトロ抗バイオフィルム活性。ａ． NIR照射の有無にかかわらず、各グループの寒天プレート内のMRSAコロニーの代表的な画像。 b 各グループの寒天プレートの結果に基づく MRSA バイオフィルムの除去効果。 c NIR照射の有無にかかわらず、各グループのMRSAバイオフィルムの走査型電子顕微鏡(SEM)画像。スケールバー = 2 μm。赤い矢印は損傷した細胞膜を示します。 d NIR照射下でのDCFH-DAプローブによる各グループのMRSAのROS FL強度。 e NPN蛍光プローブによるさまざまな条件下でのMRSAの相対FL強度、ポリミキシンBをポジティブコントロールとして使用しました。実験グループの蛍光強度は、NIR 照射なしの純粋な Ti の蛍光強度に正規化されました。 f 蛍光分光光度計で測定された各グループの MRSA の相対 ATP 強度。実験グループの相対蛍光強度は、蛍光強度を NIR 照射なしの純粋な Ti の蛍光強度に対して正規化することによって得られました。 g 分光光度マイクロプレートリーダーを使用した各グループの MRSA の ONPG 加水分解。 **P < 0.01; Tiチタン、PDAポリドーパミンナノ粒子、SNPニトロプルシドナトリウム、OGP骨形成成長ペプチド、NIR近赤外光、MRSAメチシリン耐性黄色ブドウ球菌スキャン、ROS活性酸素種、DCFH-DA 2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート、NPN 1- N-フェニルナフチルアミン、FL 蛍光、ATP アデノシン三リン酸、ONPG o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド

MRSAバイオフィルムは、NIR照射なしでTi、Ti-PDA、Ti-PDA@SNPまたはTi-PDA@SNP-OGP上で暗紫色に染色されました（追加ファイル1：図S3a）。 NIR照射後、Ti-PDA@SNPおよびTi-PDA@SNP-OGP上の染色はより明るくなり、バイオフィルムバイオマスはそれぞれ0.31および0.37でした（ P < 0.01、追加ファイル1：図S3b）。バイオフィルムバイオマスは、Ti-PDA@SNP および Ti-PDA@SNP-OGP に対する 2 分間の NIR 照射後、それぞれ 68.9% および 72.3% に減少しました。 MRSAバイオフィルムを長時間（10分以上）照射すると、Ti-PDA@SNPおよびTi-PDA@SNP-OGP上のバイオフィルムバイオマスはそれぞれ8.1％および13.3％に減少しました（追加ファイル1：図S3c）。。抗生物質バンコマイシンの抗バイオフィルム能力を、Ti または NIR 照射 Ti-PDA@SNP-OGP を使用して達成される効果とさらに比較しました。バンコマイシンの MRSA 生存率は 29.6% であり、NIR 照射 Ti-PDA@SNP-OGP の生存率 (8.3%) よりも有意に高かった (P < 0.01、追加ファイル 1:図 S3d)。さらに、NIR照射したTi-PDA@SNP-OGPの相対的なバイオフィルムバイオマスは、Ti（100.0％）およびバンコマイシン（95.6％、 P < 0.01、追加ファイル1：図S3e）よりも大幅に低かった（10.4％）。。まとめると、これらの結果は、Ti-PDA@SNP-OGP による温熱と光熱誘発性 NO 放出が MRSA に対して相乗的な抗菌効果を示し、MRSA バイオフィルムを効果的に根絶できることを示しています。

ROS レベルは DCFH-DA プローブを使用して調査されました。 NIR照射後、TiまたはTi-PDAと比較して、Ti-PDA@SNPまたはTi-PDA@SNP-OGPではROSレベルがはるかに高くなります（P <0.01;図2d）。比較すると、NIR照射がない場合、すべてのグループのROSレベルは同様でした（追加ファイル1：図S3f）。 NIR照射がなければ、Ti-PDA、Ti-PDA@SNP、およびTi-PDA@SNP-OGPの相対FL強度は、Tiグループと比較して明らかに増加しませんでした。レーザー照射下では、Ti-PDA@SNPおよびTi-PDA@SNP-OGPの相対FL強度は有意に増強され、ポジティブコントロールと同様でした（P <0.01、図2e）。 Tiと比較して、Ti-PDA@SNP-OGPは、NIR照射後にATP強度のより顕著な低下（〜63.5％）（図2f）、およびNIR照射後のBCA漏出のより広範囲の範囲（〜2.6倍）を示しました（追加ファイル1：図S3g）。対照的に、NIR照射したTi-PDAではATP強度が30.5％減少するだけであり（図2f）、BCA漏出は1.75倍増加しました（追加ファイル1：図S3g）。 ONPG の加水分解を使用して、細菌膜の損傷の程度を調べました (つまり、細菌の膜が損傷すると、ONPG の加水分解の程度が増加します)。ＮＩＲ照射がなければ、Ｔｉと比較した場合、Ｔｉ－ＰＤＡ、Ｔｉ－ＰＤＡ＠ＳＮＰ、およびＴｉ－ＰＤＡ＠ＳＮＰ－ＯＧＰにおけるＯＮＰＧ加水分解の程度の差は無視できるほどであった。 NIR照射後、Ti-PDA@SNPまたはTi-PDA@SNP-OGPにおけるONPG加水分解の程度は、TiまたはTi-PDAにおけるものよりも有意に高かった（P<0.01、図2g）。さらに、呼吸鎖デヒドロゲナーゼ活性をさまざまな処理後に測定しました。呼吸鎖デヒドロゲナーゼは、NIR照射後にTi-PDA@SNPまたはTi-PDA@SNP-OGP中で不活性化されました（P <0.01、追加ファイル1：図S3h）。細菌の膜透過性の変化は、通常、デオキシリボ核酸 (DNA) やリボ核酸 (RNA) などの細胞内成分の漏出に関連しています。 Ti-PDA@SNP-OGP 内の MRSA バイオフィルムは、NIR 照射後の細胞内成分の漏出が著しく高濃度であることを示しました (P < 0.05 または P < 0.01、追加ファイル 1: 図 S3i)。これは ONPG の結果と一致しています。加水分解。まとめると、これらの結果は、ROS 媒介の酸化ストレス、細菌膜の完全性の破壊、細胞内成分の漏出が、Ti-PDA@SNP-OGP によって誘導される細菌死と MRSA バイオフィルムの根絶の主な要因であることを示しています。

MSCの形態と広がり領域は、蛍光染色を使用して評価されました。図3aに示すように、Tiまたは機能化Ti基板上で培養されたMSCは紡錘形の形態を示しました。 Ti-PDA@SNP-OGP 上で培養した MSC からは、さらに多くの偽足が同定されました。定量的分析により、MSCの拡散領域は他のグループと比較してTi-PDA@SNP-OGPで大きいことが示されました（P < 0.01、追加ファイル1：図S4a）。 MSC の細胞生存率は、1、4、および 7 日間培養した後、CCK-8 アッセイを使用して評価されました。 Ti、Ti-PDA、および Ti-PDA@SNP 上で培養した細胞と比較して、Ti-PDA@SNP-OGP 上で培養した MSC の細胞生存率は有意に高かった（P < 0.05 または P < 0.01、図 3b）。 10分間のNIR照射後、Ti中のMSCの細胞生存率は85.4％に減少し、これはTi-PDA（68.9％）、Ti-PDA@SNP（53.2％）、Ti-PDA@SNP-中の細胞生存率よりも高かった。それぞれOGP（58.8％）（P < 0.01、追加ファイル1：図S4b）。一方、Ti-PDA@SNPおよびTi-PDA@SNP-OGPにおける細胞生存率は、Ti-PDAにおける細胞生存率よりも有意に低かった（P < 0.05、追加ファイル1：図S4b）。その後、細胞を通常の条件でさらに培養したところ、1日後、Ti-PDA@SNP-OGPではTiよりもMSCの細胞生存率が有意に低下することが判明した(P<0.01)。 4日目には、Ti群とTi-PDA@SNP-OGP群の間で統計的に有意な差は確認されませんでしたが（ P > 0.05）、7日目に有意差が見つかりました（ P < 0.01、追加ファイル1：図S4c）。 NIR照射Ti-PDA@SNP-OGP上で培養したMSCの細胞生存率(LDHアッセイを用いて測定)は、陽性対照群(MSRAなしのTi上で培養したMSC)の細胞生存率に近似した。ただし、NIR照射後、Ti、Ti-PDA、およびTi-PDA@SNPの細胞生存率は、Ti-PDA@SNP-OGPの細胞生存率よりも大幅に低かった（P <0.01、追加ファイル1：図S4d）。バイオフィルム除去後、Ti-PDA@SNP-OGP の骨形成能を評価するために、蛍光染色と ALP 活性アッセイを実行しました。 NIR照射なしのTi-PDA@SNP-OGP(バージン)を対照として使用した。 Ti-PDA@SNP-OGP (使用済み) と Ti-PDA@SNP-OGP (未使用) で培養した MSC は同様の正常な形態を示し、明らかな違いは見つかりませんでした。これは、NIR 照射した Ti-PDA@SNP-OGP が効果的に培養できることを間接的に反映しています。 MRSAバイオフィルムを根絶しますが、MSCの生物学的機能には影響を与えません（追加ファイル1：図S4e）。さらに、Ti-PDA@SNP-OGP（MRSAバイオフィルムが根絶された後）におけるMSCのALP活性は、Tiよりも有意に高かった（P < 0.05）（追加ファイル1：図S4f）。

Ti または機能化 Ti 基板上の MSC の細胞増殖および骨形成の評価。 a Ti または官能化 Ti 基板、Hoechst 33258 (青) およびアクチン (赤) 上の MSC の蛍光画像。スケールバー = 200 μm。 b CCK-8アッセイによるTiまたは官能化Ti基板上のMSCの細胞増殖。 c 7日間のインキュベーション後のTiまたは官能化Ti基板上のMSCのALP活性。 d Tiまたは官能化Ti基板上のMSCのコラーゲン分泌は、シリウスレッド染色によって検出および定量されました。 e 各サンプル中のMSCのECM石灰化は、アリザリンレッド染色によって測定および定量化されました。 f qRT-PCR によって測定された骨形成関連遺伝子 Runx2、BMP2、OPN、および OCN の mRNA 発現。 *P < 0.05、**P < 0.01; Tiチタン、PDAポリドーパミンナノ粒子、SNPニトロプルシドナトリウム、OGP骨形成成長ペプチド、MSC骨髄間質細胞、ALPアルカリホスファターゼ、ECM細胞外マトリックス、Runx2ラント関連転写因子2、BMP2骨形成タンパク質2、OPNオステオポンチン、OCNオステオカルシン、qRT ‑PCR 定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応

7日間培養した後、Ti-PDA@SNP-OGP上で培養したMSCは、他のグループよりも高いALP活性を示しました（P <0.01、図3c）。同様の傾向がコラーゲン分泌とECM石灰化でも観察されました（図3d、e）。 qRT‑PCR を使用して、MSC における骨形成関連遺伝子 [Runt 関連転写因子 2 (Runx2)、骨形成タンパク質 2 (BMP2)、オステオポンチン (OPN)、オステオカルシン (OCN)] の mRNA 発現プロファイルを調査しました。 Runx2、BMP2、OPN、およびOCNの発現レベルは、Ti-PDA@SNP-OGPでは他のグループよりも著しく高いことがわかりました（P <0.05またはP <0.01、図3f）。

Ti または機能化 Ti 基板上で培養された RAW264.7 細胞の形態は、蛍光染色によって初めて観察されました。 Ti、Ti-PDA、またはTi-PDA@SNPで培養したものと比較して、Ti-PDA@SNP-OGPで培養したRAW264.7細胞では、より多くの仮足（点線の白丸で示す）が観察されました（図4a）。 SEM画像は、他のグループと比較して、より多くのRAW264.7細胞がTi-PDA@SNP-OGP基板に接着していることを示しました（図4b）さらに、Ti-PDA@SNP-OGPは、他のグループと比較してRAW264.7細胞の増殖を有意に増強しました。他のグループとの比較（P < 0.01、図4c）。さらに、マクロファージの極性もqRT-PCRによって評価されました。図4dに示すように、M1マーカー遺伝子（CD86、iNOS、およびCD11C）は、他のグループと比較してTi-PDA@SNP-OGPによって有意な下降傾向を示し（P <0.05またはP <0.01）、その抗炎症活性を示唆しています。比較すると、M2 マーカー遺伝子 (CD206、Arg-1、および CD163) の mRNA 発現レベルは、Ti、Ti-PDA、または Ti-PDA@SNP と比較して、Ti-PDA@SNP-OGP によって有意に上方制御されました (P < 0.01) ）。

インビトロでのマクロファージ表現型再プログラミングおよび抗炎症能力に対する Ti または機能化 Ti 基質の効果。 24時間培養後のTiまたは機能化Ti基板上のRAW 264.7細胞の細胞骨格染色、Hoechst 33258（青）およびアクチン（赤）。スケールバー = 50 μm。白い点線の円は仮足を表します。 b 24 時間培養後の Ti または官能化 Ti 基板上の RAW264.7 細胞の走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像。スケールバー = 5 μm。 c 1、3、および5日間培養した後のさまざまなサンプルにおけるRAW264.7細胞の細胞生存率。 d リポ多糖（LPS）刺激RAW264.7細胞におけるM1マーカー遺伝子CD86、iNOSおよびCD11C、ならびにM2マーカー遺伝子CD206、Arg-1およびCD163のmRNA発現。 e RAW264.7細胞におけるRunx2、BMP2、VEGFおよびTGF-β遺伝子のmRNA発現。 f LPS刺激されたRAW264.7細胞における炎症誘発性遺伝子IL-1βおよびTNF-α、ならびに抗炎症性遺伝子IL-1raおよびIL-10のmRNA発現。 *P < 0.05、**P < 0.01; Tiチタン、PDAポリドーパミンナノ粒子、SNPニトロプルシドナトリウム、OGP骨形成成長ペプチド、CD86分化クラスター86、iNOS誘導性一酸化窒素シンターゼ、CD11C分化クラスター11C、CD206分化クラスター206、Arg-1アルギナーゼ-1、CD163クラスター分化 163、Runx2 ラント関連転写因子 2、BMP2 骨形成タンパク質 2、VEGF 血管内皮増殖因子、TGF-β トランスフォーミング増殖因子 -β、IL-1β インターロイキン -1β、TNF‑α 腫瘍壊死因子 -α、IL- 1ra インターロイキン-1ra、IL-10 インターロイキン-10

Runx2、BMP2、VEGF、および TGF-β の mRNA 発現レベルを RAW264.7 細胞でさらに調査しました。 Tiと比較して、Ti-PDA@SNP-OGPにおけるRunx2、BMP2、VEGFおよびTGF-βのmRNA発現レベルは、それぞれ最大1.8、2.5、3.1および2.7倍に増加しました（P <0.01、図4e）。 Ti-PDA@SNP-OGP の抗炎症能も評価されました。他のグループと比較して、Ti-PDA@SNP-OGP では炎症促進遺伝子 IL-1β および TNF-α の mRNA 発現レベルが下方制御されていたのに対し、抗炎症遺伝子 IL の mRNA 発現は逆の傾向を示しました。 -1ra および IL-10 (P < 0.01、図 4f)。まとめると、これらの結果は、不利な炎症誘発性微小環境を逆転させ、マクロファージを M2 表現型に再プログラムし、それによって再生促進性微小環境を作り出す Ti-PDA@SNP-OGP の促進効果を強調しています。

NIR 照射後の MSC の骨形成分化能と RAW264.7 細胞による炎症因子の発現を評価しました。 Ti-PDA@SNP-OGP と NIR 照射した Ti-PDA@SNP-OGP の間に統計的に有意な差は見つかりませんでした (P > 0.05)。一方、Ti-PDA@SNP-OGP における MSC の石灰化は、NIR 後の他のグループよりも高かったです。照射（P < 0.01、追加ファイル1：図S4g）。さらに、10分間のNIR照射後、RAW264.7細胞のTi-PDA@SNP-OGPにおけるM1マーカーCD86のmRNA発現レベルは、他のグループよりも有意に低かった（P<0.01、追加ファイル1：図S4h）。さらに、Ti-PDA@SNP-OGP と NIR 照射 Ti-PDA@SNP-OGP の間で CD86 の発現レベルに統計的に有意な差はありません (P > 0.05)。 RAW264.7細胞におけるM2マーカーCD206の発現については、逆の傾向が観察されました（追加ファイル1：図S4h）。バイオフィルム除去後、CCK-8 および ALP 活性アッセイを使用して、使用した Ti-PDA@SNP-OGP と MSC の相互作用を in vitro で調査しました。 1 回目または 2 回目に使用された Ti-PDA@SNP-OGP 上の MSC は、3 回使用された Ti または Ti-PDA@SNP-OGP 上の MSC よりも有意に高い細胞生存率を示しました (P < 0.05 または P < 0.01、追加ファイル 1:図S4i）。同様に、1 回目または 2 回目に使用した Ti-PDA@SNP-OGP 上の MSC の ALP 活性は、7 日間のインキュベーション後に 3 回使用した Ti または Ti-PDA@SNP-OGP 上の MSC の ALP 活性よりも高かった (P < 0.05、追加ファイル 1: 図 S4j)。まとめると、結果は、温熱療法と Ti-PDA@SNP-OGP による光熱誘発 NO 放出を 2 回繰り返すことで、確立されたバイオフィルムを根絶し、バイオフィルム根絶後の MSC の骨形成分化を改善できることを示しています。

Ti-PDA@SNP-OGP に曝露された RAW264.7 細胞は、Runx2、BMP2、VEGF、および TGF-β の mRNA およびタンパク質の発現が大幅に向上していることがわかりました（P < 0.01、追加ファイル 1：図 S5a、b）。さらに、Transwell 共培養システムを利用して、MSC に対する Ti-PDA@SNP-OGP によって誘導された RAW264.7 細胞の in vitro 骨形成促進効果をさらに評価しました。 RAW264.7細胞を下部チャンバーの異なる基質に播種し、MSCを上部チャンバーで培養しました（追加ファイル1：図S5c）。 1日間の共培養後、Ti-PDA@SNP-OGPでより多くの遊走MSCが見つかりました（追加ファイル1：図S5d）。これは、すべてのグループの中で最も高い膜貫通遊走を示しました（ P < 0.05または P < 0.01）。定量分析により、間葉系幹細胞のALP活性、コラーゲン分泌レベルおよびECM石灰化が、Ti-PDA@SNP-OGPにおいて他のグループよりも有意に高いことが示された(P<0.01)。同様に、Ti-PDA@SNP-OGPでは、コラーゲン線維のより大きなシリウスレッド染色領域とカルシウム沈着物のアリザリンレッド染色領域が見つかりました（追加ファイル1：図S5e）。さらに、骨形成関連遺伝子Runx2、BMP2、ALP、OPN、OCNの発現レベルは、Ti-PDA@SNP-OGPグループで最も高かった（P <0.01、追加ファイル1：図S5f）。

インビトロの結果を検証するために、MRSA感染大腿骨欠損移植モデルが正常に確立されました（追加ファイル1：図S6a）。 SEM画像は、Ti-PDA@SNP-OGPが移植中に損傷していないことを示しました（追加ファイル1：図S6b）。移植前に、Ti および Ti-PDA@SNP-OGP ロッドを MRSA バイオフィルムとともに 2 日間インキュベートしました。インプラント上の MRSA バイオフィルムの形成を SEM で検査しました。 MRSA懸濁液と2日間インキュベートした後、すべてのインプラントがMRSAバイオフィルムで覆われていることが判明しました（追加ファイル1：図S6c）。すべてのインプラントに付着した MRSA は、超音波エネルギーによって剥離されました。定量分析の結果、MRSA は Ti (2.71 × 107 CFU)、Ti-PDA (2.60 × 107 CFU)、Ti-PDA@SNP (2.46 × 107 CFU)、および Ti-PDA@SNP-OGP (2.66 × 107CFU）。

注入の 1 日後、Ti または Ti-PDA@SNP-OGP インプラントの注入部位を 808 nm のレーザー照射にさらしました。光熱画像と対応する温度変化が記録されました（追加ファイル1：図S6d）。 10 分間の照射後の Ti-PDA@SNP-OGP インプラントの温度変化 (ΔT) は 23.7 °C で、Ti インプラントの温度変化 (12.1 °C、P < 0.01、追加ファイル 1) よりも大幅に高かった。：図S6e）。 3 日間の移植後、両方のインプラントを静かに取り外し、MHB に 12 時間浸漬しました。暗所でインキュベートした後、Ti または Ti-PDA@SNP-OGP インプラントを含む MHB 培地は糞便でした。これは、NIR 照射なしでは Ti および Ti-PDA@SNP-OGP の抗菌能力が不十分であることを示しています。 NIR照射後、Ti-PDA@SNP-OGPインプラントを含むMHB培地は透明になりましたが、Tiインプラントを含むMHB培地は糞便のままでした（追加ファイル1：図S6f）。広げたプレートの定量分析により、NIR 照射なしでは MRSA バイオフィルムの 6.2% のみが除去されたことが示されました。対照的に、Ti-PDA@SNP-OGP インプラント上の MRSA バイオフィルムの 95.7% 以上が NIR 照射後に除去されました (P < 0.01、追加ファイル 1:図 S6g)。誘導結合プラズマ原子発光分光法 (ICP-AES) を使用して管腔内大腿骨髄中の Fe イオン含有量を調査し、事前に決定された時点 (0.5、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5、0.5、 1、3、7、14、および 28 d)。管腔内大腿骨髄に蓄積した Fe イオンの割合は、28 日の時点で Ti-PDA@SNP-OGP 中で 7.54% でした。特に、生体内におけるTi-PDA@SNP-OGP基質におけるOGPの半減期は約7日であった。対照的に、Ti中のFeイオンの累積量はわずか0.9％でした（P < 0.01、追加ファイル1：図S6h）。まとめると、微生物学的評価により、Ti-PDA@SNP-OGP インプラントが生体内で光熱作用と NO 抗菌作用および MRSA バイオフィルム根絶作用の組み合わせを示すことが実証されました。

抗炎症能を評価するために、ELISA を実行して、排出される炎症促進性サイトカイン (TNF-α および IL-6) および抗炎症性サイトカイン (TGF-β および IL-10) の濃度を定量しました。 NIR照射したTi-PDA@SNP-OGPは、TNF-αおよびIL-6のタンパク質発現レベルが最も低かった（P < 0.01、追加ファイル1：図S6i）。 Ti-PDA@SNP-OGP では、NIR 照射した Ti-PDA@SNP-OGP よりも TNF-α と IL-6 の含有量が有意に高かったが、抗炎症性サイトカイン TGF の含有量が高いほど逆の傾向を示した。 -βおよび後者によって分泌されるIL-10（P < 0.01、追加ファイル1：図S6i）、これは光熱によって引き起こされるNO生成に起因すると考えられます。

HE およびギムザ染色を使用して、生体内移植後 3 日目の炎症反応を分析しました。 NIR 照射 Ti-PDA@SNP-OGP では、少数の炎症細胞 (赤い矢印で示す) と残留細菌 (赤い矢印で示す) のみが同定されました。これは、定量的結果によってさらに確認されました (P < 0.05 または P < 0.01、追加ファイル 1: 図 S7a)。逆に、他のグループでは炎症細胞の多量の浸潤と多くのMRSA細胞が観察されました（P < 0.01、追加ファイル1：図S7b）。

骨とインプラントの界面では、CD86によるM1マクロファージおよびCD206によるM2マクロファージのIHC染色が実行されました（追加ファイル1：図S7c）。 NIR 照射した Ti-PDA@SNP-OGP では、CD86 陽性マクロファージの分布は顕著な減少を示しましたが、CD206 陽性マクロファージの主に強い傾向を示しました。まとめると、これらの結果は、インビトロの結果と一致して、抗炎症およびマクロファージ表現型の再プログラミングを媒介するインプラントの可能性を実証している。

図5aに示すように、NIR照射を受けたTi-PDA@SNP-OGPグループでは、より多くの新骨形成が観察されました。総骨量に対する新骨量の割合 (BV/TV)、小柱板の厚さ (Tb.Th)、小柱数 (Tb.N)、および小柱間隔 (Tb.Sp) を調査し、計算しました。 BV / TV、Tb.Th、およびTb.Nの最も高いパーセンテージと、Tb.Spの最も低いパーセンテージは、NIR照射されたTi-PDA@SNP-OGPで見つかりました（図5b、追加ファイル1：図S7d）。。図5cに示すように、NIR照射Ti-PDA@SNP-OGPの表面では豊富な新骨組織の形成が観察されましたが、Ti、NIR照射Ti、またはTi-PDAでは少量の新骨しか見つかりませんでした。 4週間の治療後の@SNP-OGP。同様の結果がマッソントリクローム染色でも得られた。 NIR 照射 Ti-PDA@SNP-OGP は、新しい骨領域 (37.5%) および骨とインプラントの接触 (34.3%) の最も高い割合を示しました (P < 0.05 または P < 0.01、追加ファイル 1:図 S7e) ）、マイクロCTの結果と一致しています。 IHC 染色によるインプラント周囲骨組織周囲の骨形成関連タンパク質 (ALP および OPN) のさらなる評価により、Ti-PDA@SNP-OGP でより陽性に染色された ALP および OPN 領域が特定されました。 Ti、NIR照射Ti、Ti-PDA@SNP-OGPと比較して、NIR照射Ti-PDA@SNP-OGPはインプラント周囲のCD31発現（血管新生マーカー）の大幅な改善を示しました（追加ファイル1：図S7f）。

in vivo での MRSA 感染大腿骨欠損移植モデルにおける骨再生。 a 新しい骨のマイクロCT画像。スケールバー = 400 μm。 b マイクロ CT の三次元 (3D) 再構成画像に基づく、骨体積/総体積 (BV/TV)、骨梁の厚さ (Tb.Th)、および骨梁の数 (Tb.Th) を含む、新しく形成された骨組織の定量分析。 N) 4週間後。 c 骨とインプラントの界面における HE およびマッソンのトリクローム染色の代表的な画像。スケールバー = 200 μm。 **P < 0.01; Tiチタン、PDAポリドーパミンナノ粒子、SNPニトロプルシドナトリウム、OGP骨形成成長ペプチド、HEヘマトキシリンおよびエオシン

in vivo で Ti-PDA@SNP-OGP の PTT によって誘発される穏やかな温度 (~51 °C) の生物学的安全性は、白血球 (WBC)、好中球顆粒球 (NEUT)、赤血球を含む全血生化学分析を使用して評価されました。 RBC）、ヘモグロビン（HGB）、ヘマトクリット（HCT）、血小板（PLT）。 WBC、NEUT、RBC、HGB、HCT、および PLT インジケーターに関して、Ti と NIR 照射 Ti-PDA@SNP-OGP の間に統計的に有意な差は見つかりませんでした（追加ファイル 1：図 S8）。これらの結果は、Ti-PDA@SNP-OGP および NIR 療法に関連する明らかなリスクが体内に存在しないことを示しています。

この研究では、PDAナノ粒子を光熱感受性SNPでカプセル化し、OGPを使用して修飾し、Ti上にドーパミンコーティングを形成してPDA@SNP-OGPナノ粒子を担持し、Ti-PDA@SNP-OGPを構築しました（図6）。骨形成因子として、OGP は、in vivo での骨芽細胞系列細胞の増殖と分化を改善することにより、骨修復材料の骨形成分化能を増強するために広く使用されています。我々の以前の研究では、OGP は、RAW264.7 細胞の抗炎症能力を改善し、MSC の骨形成効果を増強するための効果的な骨免疫調節因子であることが特定されました [41、42、43]。バイら。 [44] は、炎症反応の抑制とマクロファージの M2 表現型の上方制御を介して、高度なオッセオインテグレーションのためのイガイ接着機能と骨免疫調節機能を備えた 4 価カテコール含有 (DOPA)4 修飾 OGP を作製しました。しかし、抗菌能力が低いため、OGP 修飾 Ti インプラントの臨床応用は非常に限られていました [44、45、46]。多くの研究は、単一機能（抗菌能力または強化されたオッセオインテグレーション）または二重機能（抗菌能力および強化されたオッセオインテグレーションを含む）などの、OGP 修飾 Ti インプラントの機能化のみに焦点を当ててきました。しかし、これらのアプローチは、複数の併存疾患（細菌感染、炎症など）が存在する場合にはインプラントのオッセオインテグレーションを改善しません。 Ti インプラントの表面に MRSA とそのバイオフィルムが出現すると状況が悪化するため、Ti インプラントの破損が生じます [47]。このため、我々は、RAW264.7 細胞と MSC 間のクロストークを制御してオッセオインテグレーションを強化し、NIR 照射を使用して抗菌およびバイオフィルム除去能力を提供できる多機能化コーティングを Ti 上に設計しました。

Ti-PDA@SNP-OGP が光熱誘発型 NO と免疫療法を介して MSRA バイオフィルムを除去し、オッセオインテグレーションを強化することを示す概略図。 Tiチタン、PDAポリドーパミンナノ粒子、SNPニトロプルシドナトリウム、OGP骨形成成長ペプチド、NO一酸化窒素、VEGF血管内皮成長因子、TGF-βトランスフォーミング成長因子-β、IL-10インターロイキン-10、TNF‑α腫瘍壊死因子-α

PDA の優れた光熱効果により、確立されたバイオフィルムを除去するためにレーザー照射光エネルギーによって誘発される局所的温熱療法が広く使用されています [21、23]。光熱剤による温度上昇は、その濃度、レーザー密度、レーザー照射時間、周囲温度などの要因に関連します[20、21]。ただし、バイオフィルムは 70 °C で NIR 照射を適用することによってのみ除去されます。このような温度は、アポトーシスまたは壊死を誘発することにより宿主細胞の生存率を低下させることは避けられません[48]。対照的に、PTT によって引き起こされる穏やかな温度 (約 52 °C) では悪影響は少なくなりますが、その穏やかな温度では抗菌力とバイオフィルム除去能力も大幅に低下します [23]。この研究では、Ti-PDA@SNP-OGP がレーザー照射された光エネルギーを局所的な温熱に変換しました。組織温度の上昇は、次に、SNPとPDAナノ粒子間のπ-πスタッキングおよび/または物理的吸着の破壊により、「オンデマンド」方式でSNPからのNO放出を引き起こした[40]。悪影響を最小限に抑えるために、1.0 W/cm2 のレーザー強度で 10 分間 0.5 mg/ml の PDA@SNP-OGP ナノ粒子を使用して光熱効果を調査し、温度は約 52 °C に達しました。 Ti-PDA@SNP-OGP によって集められた高熱は細菌膜を破壊し、その後 MRSA のタンパク質漏出を引き起こし、望ましい抗菌能力をもたらします。これらの結果は以前の研究[49、50]と一致しています。 NO の放出は、ニトロソ化ストレスと酸化ストレスを引き起こし、細菌の窒素代謝を破壊することによって抗菌効果を向上させることができます [51、52]。これらの結果に基づいて、NIR 照射による制御可能かつ迅速な NO の放出は、短時間でバイオフィルムを除去するための有用な手段であり、法外な温度を必要としません。

理想的なインプラントは、骨形成関連細胞の基本的な機能を調節するために優れた細胞適合性を示す必要があります [53、54]。細胞生存率、ALP 活性、コラーゲン分泌、および ECM 石灰化は、Ti-PDA@SNP-OGP によって大幅に改善されます。この研究では、骨形成関連遺伝子 Runx2、BMP2、OPN、OCN が他のグループと比較して Ti-PDA@SNP-OGP で有意に上方制御されていました。これらの結果は、Ti-PDA@SNP-OGP が MSC の骨形成分化を改善する可能性があることを示しています [42、43]。

インプラントが骨組織に埋め込まれると、マクロファージなどの免疫細胞が数時間以内にインプラント部位に動員されます。これらの免疫細胞は、初期の炎症反応につながる一連のイベントを生成します [55、56、57、58、59]。炎症反応は、骨MSCが補充され、血管新生が刺激されるため、骨治癒の改善に有益です[60、61、62]。炎症の後期段階では、M1 マクロファージは M2 表現型に極化し、炎症を軽減し、抗炎症性サイトカインを分泌して骨の再生を促進します [63、64、65、66、67]。それにもかかわらず、多機能マクロファージは、病理学的条件下では表現型の変化を受けることができない[59]。持続的かつ重度の炎症により、周囲の骨組織の炎症誘発性サイトカインのレベルが上昇します。これらの炎症誘発性サイトカインは、破骨細胞の活性を増強し、間葉系幹細胞の補充または遊走を減少させます。これにより、骨が切断され、オッセオインテグレーションが低下します[68,69,70,71,72]。この研究では、Ti-PDA@SNP-OGP は、M1 マーカー CD86、iNOS、および CD11C の mRNA 発現レベルを有意に下方制御し、M2 マーカー CD206、Arg-1、および CD163 の mRNA 発現レベルを上方制御しました。さらに、Runx2、BMP2、VEGF、および TGF-β 遺伝子の mRNA 発現レベルは、Ti-PDA@SNP-OGP によって有意に上方制御されました。さらに、他のグループと比較して、Ti-PDA@SNP-OGP は炎症誘発性サイトカイン IL-1β および TNF-α の mRNA 発現レベルも阻害し、抗炎症性サイトカイン IL-1ra および IL-10 の発現を増強しました。これは、Ti-PDA@SNP-OGP の骨免疫調節効果によるものである可能性があります [42、46]。

MSCとRAW264.7細胞間のクロストークは、インプラントのオッセオインテグレーションの改善に重要な役割を果たしています[72、73、74]。したがって、Ti-PDA@SNP-OGP の刺激による MSC に対する RAW264.7 細胞の骨形成誘導効果は慎重に考慮される必要があります。 RAW264.7 細胞における Runx2、BMP2、VEGF、および TGF-β の mRNA およびタンパク質の発現は上方制御されており、これは、Ti 上の OGP の固定化が RAW264.7 細胞を刺激して骨形成メディエーターを分泌させることに起因すると考えられます [44, 46]。 Ti-PDA@SNP-OGP 中の MSC は、RAW264.7 細胞との共培養後、すべてのグループの中で最も高い膜貫通遊走を示しました。さらに、Ti-PDA@SNP-OGP における ALP 活性、コラーゲン分泌および ECM 石灰化は、Ti、Ti-PDA、または Ti-PDA@SNP よりも高かった。さらに、Ti-PDA@SNP-OGP は、MSC における骨形成関連遺伝子 Runx2、BMP2、ALP、OPN、OCN の発現を刺激することが証明されました。上記の結果に基づいて、我々は、Ti-PDA@SNP-OGP が、RAW264.7 細胞からの抗炎症性メディエーターの放出を促進し、複数のパラクリンシグナル伝達を介して MSC の遊走と分化を改善する潜在的に効果的な骨免疫調節剤であることを示唆しました。 Runx2、BMP2、VEGF、および TGF-β の分析。

in vivo での抗菌および抗炎症能力の評価では、NIR 照射後に Ti-PDA@SNP-OGP インプラント上の MRSA バイオフィルムの 95.7% 以上が除去されました。さらに、MRSAバイオフィルム除去に対する軽度の温熱と光熱誘発性NO放出の相乗効果により、NIR照射後のTi-PDA@SNP-OGPでは炎症細胞と残留細菌がわずかしか観察されなかった[17、23]。私たちが設計した Ti-PDA@SNP-OGP の潜在的な抗菌メカニズムを以下に詳しく説明します。第一に、温熱療法は細菌を外部環境に対してより敏感にし、その後細菌膜に効率的に損傷を与える可能性があり、これが MRSA バイオフィルム除去のプロセスにおいて主要な役割を果たす可能性があります。第二に、光熱によって引き起こされる NO は窒素代謝を破壊し、ニトロソ化/酸化ストレスを誘発し、MRSA 死を引き起こす可能性があります。第三に、免疫療法は侵入細菌に対する宿主の防御を改善し、残留細菌に対する抗菌特性を高めることができます[75]。さらに、Ti-PDA@SNP-OGP は、炎症誘発性サイトカイン TNF-α および IL-6 のダウンレギュレーション、および抗炎症性サイトカイン TGF-β および IL-10 のアップレギュレーションを介して炎症反応を抑制する優れた能力を備えています。抗炎症反応の増強は、NIR 照射した Ti-PDA@SNP-OGP の優れた抗菌活性と OGP の免疫調節効果に起因すると考えられます [42]。 in vivo ICP-AES の結果は、Ti-PDA@SNP-OGP が主に大腿骨の骨髄腔に分布していることを示唆しました。 Ti-PDA@SNP-OGP コーティングは最初の 7 日間で急速に劣化し、その後 21 日間にわたって劣化が減少しました。これらの結果は、Ti-PDA@SNP-OGP が持続的な劣化特性を備えていることを実証しました。このような機能は、オッセオインテグレーションの強化に役立ちます。

マイクロ CT では、Ti-PDA@SNP-OGP で BV/TV、Tb.Th、Tb.N の割合が最も高く、Tb.Sp の割合が最も低いことが確認されました。骨形成関連タンパク質ALP、OPN、およびCD31のIHC染色は、ALP、OPN、およびOCNのより高い発現によって示されるように、NIR照射したTi-PDA@SNP-OGPが他のグループと比較してより良好な骨形成を示すことを示唆した。まとめると、Ti-PDA@SNP-OGP の骨免疫調節効果により、優れたオッセオインテグレーションが同時に達成されました。

いくつかの制限にさらに対処する必要があります。 MSC および RAW264.7 細胞の生理学的機能に対する光熱の影響については、さらに調査する必要があります。 NIR 照射後の OGP の生物活性特性が不活性化されるかどうか、また感染大腿骨移植モデルにおける NO の in vivo 放出が可能かどうかを徹底的に調査する必要があります。 NO は炎症性分子であるため、マクロファージへの NO のフィードバックと周囲の組織に対する NO の潜在的な悪影響をさらに調査する必要があります。細胞の挙動に関しては、動的で、連動し、時空間的に調節された特性を示しますが、間葉系幹細胞やマクロファージの生理学的機能は、時空間的な合図に応答して私たちが作製したTiインプラントによって正確に制御されませんでした。したがって、MSCおよびRAW264.7細胞の生理学的機能の正確な制御と、優れた抗菌性およびバイオフィルム除去特性を達成する多機能Tiインプラントの作製は、オッセオインテグレーションを強化するためのより合理的なアプローチとなる可能性があります。

この研究では、MRSAバイオフィルムとその根絶のために、PDAを介した界面官能基化に基づいて、Tiインプラント上のNO応答性増強型マイルドPTTおよび骨免疫調節性OGPを備えた新規なNIR活性化可能な多機能界面を初めて提案した。オッセオインテグレーションの強化。我々は、Ti-PDA@SNP-OGP が NO 放出を制御するための理想的なプラットフォームであることを実証しました。具体的には、NO は、SNP 分子と PDA の間の特別な π-π スタッキング相互作用および/または物理吸着を通じて Ti-PDA@SNP-OGP にロードされました。 Ti-PDA@SNP-OGP は、808 nm レーザー照射時に強力な光熱効果を示すことが判明し、NO の制御放出にとって理想的な外部刺激条件を提供します。特に、NO 放出は断続的な NIR 照射によって正確に制御でき、「オン-オフ」スイッチモードを示します。

NIR 照射により、Ti-PDA@SNP-OGP は MRSA の増殖を有意に阻害することにより、光熱効果と NO 抗菌効果の相乗効果を示しました。さらに、MRSA によって形成されたバイオフィルムは、光熱処理と NO 処理の組み合わせによって効果的に除去されました。抗菌メカニズムは、Ti-PDA@SNP-OGP で処理された細菌が、ROS 媒介の酸化ストレス、細菌膜の完全性の破壊、および細菌内容物の漏出によって殺菌されることを示しました。 in vitro 実験により、Ti-PDA@SNP-OGP は MSC の骨形成分化を促進するだけでなく、M1 マクロファージを抑制する一方、治癒促進 M2 表現型を刺激し、それによって損傷した微小環境を再生促進微小環境に再構築することが明らかになりました。ターン、マルチシグナル伝達経路のクロストークを介して骨形成を促進し、炎症を抑制しました。

さらに、インプラント関連感染のラットモデルにおいて、Ti-PDA@SNP-OGP は形成された MRSA バイオフィルムを除去し、付随する炎症を緩和し、骨免疫調節を媒介し、優れたオッセオインテグレーションをもたらしました。 in vitro および in vivo 生体適合性評価の両方で、Ti-PDA@SNP-OGP および NIR 療法が生物医学用途に安全であることが示唆されたことに留意されたい。総合すると、この研究は、MRSA バイオフィルムを根絶し、オッセオインテグレーションを強化する多機能 Ti インプラントを作製するための有望な戦略を提供します。

現在の研究で使用されているデータと資料はすべて、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

アルカリホスファターゼ

アルギナーゼ-1

アデノシン三リン酸

生体材料関連感染症

ビシンコニン酸

骨形成タンパク質2

N,N'-ジセクブチル-N,N'-ジニトロソ-p-フェニレンジアミン

総骨体積に対する骨体積

細胞計数キット-8

コロニー形成ユニット

3,3’-ジアミノベンジジン

2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート

ダルベッコ修正イーグル培地

細胞外マトリックス

酵素免疫測定法

細胞外高分子物質

フーリエ変換赤外分光法

S-ニトロソグルタチオン

ヘマトクリット

ヘモグロビン

ヘマトキシリンとエオシン

誘導結合プラズマ発光分光法

免疫組織化学

インターロイキン‑6

インターロイキン‑10

インターロイキン-1β

大量の凝集力

粘着力の負荷

リポ多糖類

L-アルギニン

ミュラーヒントンスープ

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌

骨髄間質細胞

好中球顆粒球

近赤外線

一酸化窒素

ジアゼニウムジオラート

オステオカルシン

骨形成成長ペプチド

O-ニトロフェニル-β-d-ガラクトピラノシド

オステオポンチン

ポリドーパミンナノ粒子

血小板

光温熱療法

定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応

赤血球

活性酸素種

Runt関連転写因子2

電子顕微鏡で観る

ニトロプルシドナトリウム

小柱数

小柱の分離

小柱板の厚さ

トランスフォーミング成長因子-β

チタン

腫瘍壊死因子-α

血管内皮増殖因子

白血球

水接触角

X線光電子分光装置

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著者らは、ご協力いただいた研究室の学生および技術者の皆様に感謝いたします。

この研究は、中国国家自然科学財団 (82101069、82102537、82160411、82002278)、重慶科学技術委員会自然科学財団 (CSTC2021JCYJ-MSXMX0170、CSTB2022BSXM-JCX0039)、重慶医療第一附属病院によって財政的に支援されました。大学育成基金（PYJJ2021-02）、北京市科学技術委員会（Z221100007422130）、人民解放軍の青少年医療科学技術育成プログラム（21QNPY116）。

Yong-Lin Yu、Jun-Jie Wu、Chuan-Chuan Lin はこの作業に同様に貢献しました。

中国、貴州省、563003、淳義医科大学附属病院病理学部

ユー・ヨンリン

検査研究センター、重慶医科大学第一付属病院、重慶、400016、中国

ジュン・ジエ・ウー & バイロン・タオ

400037 中国、重慶市陸軍陸軍医科大学第 2 付属病院放射線生物学研究所輸血科

チュアン・チュアン・リン

重慶市女性児童保健センター生殖内分泌科、重慶市、401147、中国

シアン・チン

オーガスタ大学大学院、オーガスタ、ジョージア州、30912、米国

フランクリン・R・テイ

人民解放軍総合病院第 7 医療センター口腔科、北京、100700、中国

リー・ミャオ＆ヤン・ジャオ

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LM、BLT、YJ は研究のアイデアを考案し、実験を計画し、データを解釈しました。 YLY、JJW、CCL、XQ が実験を実施しました。 LM、BLT、YJ が原稿を書きました。 FRT、BLT、YJ が原稿を改訂しました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Yong-Lin Yu、Li Miao、Bai-Long Tao、Yang Jiao に相当します。

すべての in vivo 動物実験は、重慶医科大学および人民解放軍総合病院第 7 医療センターの実験動物の動物実験に関する施設ガイドラインおよび関連規制に従って実施され、重慶医科大学の動物倫理委員会によって承認されました (2021- 738) および人民解放軍総合病院第 7 医療センター (2021-110)。

適用できない。

著者らは、競合する金銭的利害関係がないことを宣言します。

この研究ではMSCおよびRAW 264.7細胞用のqRT-PCRプライマーを使用しました。図S1。 Ti-PDA@SNP-OGP の特性評価。図S2。 Ti-PDA@SNP-OGP 基板の特性評価。図S3。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の阻害メカニズム。図S4。 Ti または機能化 Ti 基板の生体適合性、抗炎症性、および複製の評価。図S5。 Ti-PDA@SNP-OGP の in vitro 骨免疫調節。図S6。 in vivo での抗菌性および抗炎症性の評価。図S7。生体内での抗炎症、抗菌活性、骨再生。図S8。 in vivoでのTi-PDA@SNP-OGPのPTTによって誘発される穏やかな温度の生物学的安全性。

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転載と許可

ユウ、YL.、ウー、JJ.、リン、CC。他。光熱誘発型一酸化窒素と免疫療法によりチタンインプラント上のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌バイオフィルムを除去し、オッセオインテグレーションを強化します。 Military Med Res 10、21 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s40779-023-00454-y

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受信日: 2022 年 5 月 19 日

受理日: 2023 年 4 月 7 日

公開日: 2023 年 5 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s40779-023-00454-y

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